محلولهای مورد نیاز (بافرها)
در این دوره طرز تهیه بافرهای مورد نیاز را یاد میگیرید:
- بافر لیز کننده گلبول قرمز (RBC Lysis Buffer) ×۲۰
- بافر لیز کننده هسته گلبول سفید
- NaCl ۵ مولار
- EDTA ۱۰ میلیمولار (pH=۸)
- Tris ۱۰ میلیمولار (pH=۸)
- TE Buffer (برای حل کردن نهایی DNA)
پروتکل عملی استخراج DNA از خون به روش Salting Out
- ۲ میلیلیتر خون تازه را در فالکون ۱۵ میلیلیتری بریزید و با بافر لیز گلبول قرمز به حجم ۱۳ میلیلیتر برسانید.
- ۱۵–۳۰ دقیقه روی شیکر و در یخ قرار دهید تا گلبولهای قرمز لیز شوند.
- ۱۰ دقیقه با سرعت ۱۸۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید و supernatant را دور بریزید.
- (اختیاری) مرحله لیز را یک بار دیگر تکرار کنید تا رسوب کاملاً تمیز شود.
- به رسوب، ۱٫۵ میلیلیتر بافر لیز هسته اضافه کرده و مخلوط کنید.
- ۴۵ میکرولیتر Proteinase K اضافه کنید.
- ۱۳۰ میکرولیتر SDS ۱۰٪ اضافه کرده و خوب مخلوط کنید.
- نمونه را یک شبانهروز (یا حداقل ۳–۴ ساعت) در انکوباتور ۳۷ درجه قرار دهید.
- ۰٫۵ میلیلیتر NaCl ۵M اضافه کرده و ۱۵ ثانیه شدید تکان دهید.
- ۱۵ دقیقه با سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید.
- supernatant شفاف را به فالکون جدید منتقل کنید.
- ۴ میلیلیتر اتانول ۱۰۰٪ سرد اضافه کنید (آهسته و با احتیاط) — در این مرحله کلاف سفید DNA قابل مشاهده است.
- کلاف DNA را با نوک سمپلر برداشته، به میکروتیوب منتقل کنید و با اتانول ۷۰٪ بشویید.
- ۲۰۰ میکرولیتر TE Buffer اضافه کرده و در ۶۵ درجه به مدت ۳۰ دقیقه یا ۳۷ درجه به مدت چند ساعت قرار دهید تا DNA حل شود.
نکته مهم: در مرحله اضافه کردن اتانول باید بسیار آهسته عمل کنید تا کلاف DNA کامل و یکپارچه تشکیل شود.
بررسی کیفیت DNA
در انتهای کارگاه، DNA استخراج شده توسط شما با دستگاه الکتروفورز ژل آگارز بررسی میشود و کیفیت آن (اندازه، خلوص و مقدار) ارزیابی خواهد شد. همچنین با استفاده از دستگاه نانودراپ غلظت، کیفیت و آلودگی DNA استخراجی بررسی خواهد شد.