از یک Variant تا طراحی Primer؛ یک مسیر واقعی طراحی پرایمر
در این تمرین قرار است مسیر طراحی پرایمر را از ابتدا تا انتها برای دو Variant واقعی طی کنید؛ از پیدا کردن Transcript و توالی مناسب و مشخص‌کردن محل جهش تا طراحی Primer، بررسی Dimer، اختصاصیت، SNPهای محل اتصال و ارزیابی نهایی محصول PCR.
در پایان این تمرین باید بتوانید مسیر طراحی Primer را مستقل انجام دهید
هدف این تمرین فقط ساختن یک Primer Pair نیست. قرار است یاد بگیرید چگونه با داشتن نام ژن، Transcript و HGVS از داده اولیه به یک طراحی قابل ارزیابی برسید.
پیدا کردن توالی مناسب
با استفاده از نام ژن و Transcript accession توالی مناسب را پیدا کنید و مطمئن شوید روی Transcript درست کار می‌کنید.
مشخص کردن جایگاه Variant
HGVS داده‌شده را تفسیر کنید، محل Variant را روی توالی پیدا کنید و نوکلئوتید موردنظر را در فایل Word به‌صورت واضح مشخص کنید.
تشخیص Exon مربوطه
مشخص کنید Variant در کدام Exon قرار دارد و ارتباط میان موقعیت cDNA، Transcript و ساختار Exon/Intron را در عمل بررسی کنید.
انتخاب محدوده هدف برای PCR
ناحیه‌ای مناسب در اطراف Variant انتخاب کنید تا محل تغییر داخل Amplicon قرار بگیرد و برای طراحی Primer قابل استفاده باشد.
طراحی Primer Pair
با استفاده از PerlPrimer Primerهای Forward و Reverse را طراحی کنید و ویژگی‌هایی مانند طول، Tm، GC% و اندازه محصول را بررسی کنید.
ارزیابی اختصاصیت و کیفیت Primer
Primer Pair منتخب را از نظر Dimer، اختصاصیت در NCBI BLAST، SNPهای محل اتصال و In-Silico PCR ارزیابی کنید.
مسیر مهارتی که در این تمرین طی می‌کنید
خروجی مورد انتظار: دانشجو باید بتواند با داشتن نام ژن، Transcript و HGVS، مسیر طراحی Primer را از پیدا کردن توالی و جایگاه Variant تا انتخاب و ارزیابی Primer Pair به‌صورت مستقل طی کند.
قبل از شروع چه چیزهایی باید بدانیم؟
پیش از آنکه سراغ نرم‌افزار طراحی Primer برویم، باید دقیقاً بدانیم روی چه نوع توالی کار می‌کنیم، شماره Variant به چه مرجعی اشاره دارد و Forward Primer، Reverse Primer و Amplicon چه ارتباطی با ناحیه هدف دارند.
یک نکته بسیار مهم درباره شماره‌گذاری Variant
وقتی عبارتی مانند c.218A>G می‌بینید، عدد 218 به شماره‌گذاری توالی کدکننده در Transcript مرجع مربوط است؛ یعنی نباید آن را به‌سادگی «باز شماره ۲۱۸ ژن روی کروموزوم» در نظر گرفت. موقعیت ژنومی Variant می‌تواند عددی کاملاً متفاوت داشته باشد و برای تفسیر صحیح HGVS باید همیشه Transcript مرجع را هم در نظر بگیرید.
توالی ژنومی چیست؟
توالی ژنومی بخشی از DNA موجود روی کروموزوم است و می‌تواند شامل Exon، Intron و نواحی اطراف ژن باشد. وقتی قصد داریم Primer برای PCR روی DNA ژنومی طراحی کنیم، ساختار واقعی Exon و Intron اهمیت زیادی پیدا می‌کند.
توالی cDNA چه تفاوتی دارد؟
در cDNA، توالی حاصل از Transcript بالغ را دنبال می‌کنیم. بنابراین برخلاف توالی ژنومی، بخش‌های Intronic میان Exonها در Transcript بالغ وجود ندارند. به همین دلیل شماره‌گذاری یک Variant در cDNA با مختصات همان Variant روی ژنوم یکسان نیست.
چرا Transcript اهمیت دارد؟
یک ژن ممکن است چند Transcript مختلف داشته باشد. این Transcriptها می‌توانند در ترکیب Exonها و شماره‌گذاری موقعیت‌ها با هم تفاوت داشته باشند. بنابراین وقتی HGVS به‌صورت NM_...:c.... ارائه می‌شود، Accession و نسخه Transcript بخشی از تعریف دقیق Variant است.
Exon و Intron را چرا مشخص می‌کنیم؟
برای طراحی Primer باید بدانیم Variant در کدام قسمت ژن قرار دارد و ناحیه اطراف آن چه ساختاری دارد. در این تمرین محل Variant را روی Exon مربوطه پیدا می‌کنید و سپس نواحی اطراف آن را برای انتخاب Target Region بررسی خواهید کرد.
Forward Primer چیست؟
Forward Primer یکی از دو Primer واکنش PCR است و در یک سمت ناحیه‌ای قرار می‌گیرد که قرار است تکثیر شود. توالی آن همیشه باید با جهت 5′ → 3′ گزارش شود.
Reverse Primer چیست؟
Reverse Primer در سمت مقابل Forward Primer قرار می‌گیرد و به رشته مقابل DNA متصل می‌شود. در جدول نهایی سفارش Primer نیز توالی Reverse Primer مانند Forward Primer باید در جهت 5′ → 3′ نوشته شود.
Amplicon چیست؟
قطعه DNA که بین دو Primer قرار می‌گیرد و در PCR تکثیر می‌شود Amplicon نام دارد. Variant موردنظر باید در ناحیه‌ای مناسب از این محصول قرار گیرد تا بتوان آن را در مرحله بعد بررسی کرد.
محدوده هدف چیست؟
پیش از طراحی Primer، بخشی از توالی اطراف Variant را به‌عنوان ناحیه هدف انتخاب می‌کنیم. Primerها باید در دو سمت این ناحیه قرار بگیرند و محصول PCR باید Variant موردنظر را در خود داشته باشد. در ادامه تمرین، همین محدوده را در فایل Word نیز مشخص خواهید کرد.
عبارت c.218A>G دقیقاً چه می‌گوید؟
پیشوند c. نشان می‌دهد Variant با استفاده از سیستم شماره‌گذاری DNA کدکننده توصیف شده است. در HGVS، شماره‌گذاری c.1 از نوکلئوتید A در کدون آغاز ATG شروع می‌شود. بنابراین برای تفسیر صحیح c.218A>G باید Transcript مرجع مشخص باشد.
تفاوتی که نباید در این تمرین فراموش کنید
مختصات Variant روی کروموزوم است و براساس رفرنس ژنومی تعیین می‌شود. وجود Intronها و ساختار کامل ژن روی این مختصات اثر دارد.
موقعیتی است که Variant براساس Transcript مرجع و سیستم شماره‌گذاری HGVS توصیف می‌شود. بنابراین c.218 به معنی موقعیت ژنومی 218 نیست.
مسیر طراحی Primer را با یک Variant نمونه یاد بگیریم
قبل از اینکه سراغ BTD و TMEM38B بروید، یک مثال مستقل را مرحله‌به‌مرحله بررسی می‌کنیم. هدف این بخش ارائه Primer آماده نیست؛ هدف این است که منطق و ترتیب صحیح مراحل طراحی Primer را یاد بگیرید و سپس همین مسیر را برای مأموریت‌های اصلی خودتان تکرار کنید.
طراحی Primer در اطراف یک Variant در ژن HBB
فرض کنید اطلاعات اولیه زیر به شما داده شده است. از همین سه داده باید مسیر پیدا کردن توالی، تعیین جایگاه Variant، انتخاب ناحیه هدف و در نهایت ارزیابی Primerها را آغاز کنید.
اول Transcript مرجع را دقیق انتخاب کنید
کار را با نام ژن به‌تنهایی شروع نکنید. در این مثال Transcript مرجع NM_000518.5 است. هنگام دریافت توالی مطمئن شوید دقیقاً همین Accession و همین Version را بررسی می‌کنید؛ زیرا تفسیر HGVS به Transcript مرجع وابسته است.
HGVS را بخوانید و محل Variant را پیدا کنید
عبارت c.20A>T می‌گوید در موقعیت شماره 20 از سیستم شماره‌گذاری coding DNA، نوکلئوتید A با T جایگزین شده است. این عدد را نباید با موقعیت ژنومی روی کروموزوم یکی بدانید.
مشخص کنید Variant در کدام بخش Transcript قرار دارد
اکنون باید ساختار Transcript را بررسی کنید و محل Variant را نسبت به Exon و Intron مشخص کنید. هدف این مرحله آن است که بتوانید جایگاه Variant را از شماره‌گذاری cDNA به ساختار واقعی ژن ارتباط دهید.
توالی مناسب برای طراحی PCR را آماده کنید
حالا که محل Variant را می‌دانید، باید ناحیه ژنومی مناسب اطراف آن را استخراج کنید. توالی باید به‌اندازه‌ای از دو طرف Variant ادامه داشته باشد که نرم‌افزار بتواند گزینه‌های مناسب برای Forward و Reverse Primer پیدا کند.
ناحیه‌ای را مشخص کنید که باید در PCR تکثیر شود
Variant باید داخل محصول PCR قرار بگیرد و Primerها در دو سمت ناحیه هدف قرار بگیرند. محدوده‌ای را که برای طراحی انتخاب کرده‌اید در فایل Word نیز مشخص کنید تا بعداً بتوانید محل Primerها و Amplicon را روی همان توالی نشان دهید.
Primer Pairهای پیشنهادی را طراحی و مقایسه کنید
توالی انتخاب‌شده را وارد PerlPrimer کنید و Primer Pairهای پیشنهادی را بررسی کنید. برای هر Pair باید مشخصات Primer Forward و Reverse و ویژگی‌هایی مانند Length، Tm، GC% و Product Size را ثبت کنید.
قبل از ادامه، Primer-Dimer را بررسی کنید
اولین Primer Pair نرم‌افزار الزاماً بهترین انتخاب نیست. Primerهای منتخب را از نظر تشکیل ساختارهای نامطلوب و Dimer بررسی کنید و فقط Pairهای مناسب را برای مرحله بعد نگه دارید.
اختصاصیت Primerها را بررسی کنید
توالی Primerهای منتخب را در BLAST بررسی کنید. سؤال اصلی این است که آیا Primer فقط ناحیه موردنظر را هدف می‌گیرد یا اتصال‌های غیراختصاصی مهمی نیز مشاهده می‌شود؟
↓
ادامه بررسی
↓
بازگشت و انتخاب Primer دیگر
محل اتصال Primer را از نظر SNP بررسی کنید
Primerهایی که مراحل قبل را پشت سر گذاشته‌اند باید از نظر وجود Variant یا Polymorphism در محل اتصال نیز بررسی شوند. در این تمرین به‌خصوص پنج نوکلئوتید انتهای 3′ Primer را با دقت بررسی می‌کنیم.
محصول PCR را به‌صورت In-Silico بررسی کنید
در مرحله نهایی Forward و Reverse Primer را در In-Silico PCR بررسی کنید. خروجی باید به شما کمک کند محل اتصال Primerها و محصول مورد انتظار را روی توالی ببینید و نتیجه را با طراحی خودتان تطبیق دهید.
در فایل Word چه چیزهایی باید مشخص شوند؟
فایل Word فقط محل نوشتن جواب نیست؛ مستند مسیر طراحی شماست.
حالا نوبت شماست
در مثال HBB مسیر کار را دیدید. در مأموریت اصلی دیگر راه‌حل مرحله‌به‌مرحله در اختیار شما نیست و باید همین فرآیند را به‌صورت مستقل برای دو Variant زیر انجام دهید.
حالا مسیر طراحی Primer را خودتان اجرا کنید
در بخش آموزشی با منطق و ترتیب مراحل آشنا شدید. اکنون باید همان Workflow را به‌صورت مستقل برای دو Variant تعیین‌شده انجام دهید و نتیجه هر مرحله را در فایل Word تمرین مستند کنید.
BTD
مأموریت اولاطلاعات اولیه مأموریت
مأموریت شما
محل Variant را با استفاده از Transcript مشخص‌شده پیدا کنید، ناحیه مناسب اطراف آن را برای PCR انتخاب کنید، Primer Pair طراحی کنید و Primerهای منتخب را مرحله‌به‌مرحله ارزیابی نمایید.
مراحل مورد انتظار
- دریافت و ثبت توالی مناسب ژن در فایل Word
- پیدا کردن و Highlight کردن Variant
- مشخص کردن Exon مربوطه و نواحی اطراف
- انتخاب Target Region مناسب برای PCR
- طراحی Forward و Reverse Primer
- بررسی Primer-Dimer
- بررسی اختصاصیت Primer با NCBI BLAST
- بررسی محل اتصال Primer با SNPCheck
- بررسی محصول نهایی با UCSC In-Silico PCR
TMEM38B
مأموریت دوماطلاعات اولیه مأموریت
مأموریت شما
با استفاده از Transcript تعیین‌شده، محل Variant را پیدا کنید و سپس از انتخاب Target Region تا طراحی و اعتبارسنجی Primer Pair، تمام مراحل تمرین را به‌صورت مستقل انجام دهید.
مراحل مورد انتظار
- دریافت و ثبت توالی مناسب ژن در فایل Word
- پیدا کردن و Highlight کردن Variant
- مشخص کردن Exon مربوطه و نواحی اطراف
- انتخاب Target Region مناسب برای PCR
- طراحی Forward و Reverse Primer
- بررسی Primer-Dimer
- بررسی اختصاصیت Primer با NCBI BLAST
- بررسی محل اتصال Primer با SNPCheck
- بررسی محصول نهایی با UCSC In-Silico PCR
این مسیر باید برای هر دو مأموریت به‌طور کامل طی شود
فایل Word ژن را مرحله‌به‌مرحله بسازید
فایل Word شما فقط یک پاسخ متنی نیست؛ باید نقشه کامل مسیر طراحی Primer را نشان دهد. توالی موردنیاز را وارد فایل کنید و سپس Exonها، Intronها، محل Variant و محدوده‌ای را که برای طراحی Primer انتخاب کرده‌اید، به‌صورت واضح مشخص نمایید.
از یک فایل خالی شروع کنید
برای هر ژن، اطلاعات Gene، Transcript و HGVS را در ابتدای فایل ثبت کنید. سپس توالی موردنیاز را از منبع معتبر دریافت کرده و در Word قرار دهید. در ادامه همین توالی باید به‌صورت تصویری و رنگی Annotate شود تا مشخص باشد Variant در چه ناحیه‌ای قرار دارد و چه محدوده‌ای برای طراحی Primer انتخاب شده است.
در فایل هر ژن چه چیزهایی باید مشخص شوند؟
- 01 توالی موردنیاز توالی مورد استفاده برای طراحی را در فایل Word قرار دهید.
- 02 Exonها نواحی Exonic موجود در توالی را به‌صورت واضح از سایر بخش‌ها متمایز کنید.
- 03 Intronها نواحی Intronic اطراف Exon موردنظر نیز باید قابل تشخیص باشند.
- 04 محل Variant موقعیت Variant را روی توالی پیدا و دقیقاً مشخص کنید.
- 05 نوکلئوتید Variant نوکلئوتید مربوط به Variant را با Highlight مشخص کنید تا در توالی قابل مشاهده باشد.
- 06 Target Region محدوده‌ای از توالی را که برای طراحی Primer انتخاب کرده‌اید مشخص کنید.
- 07 محل Primerها پس از انتخاب Primer Pair نهایی، جای Forward و Reverse Primer را نیز روی همان توالی مشخص خواهید کرد.
نمونه شماتیک از ظاهر فایل Word
EXAMPLE ONLYپیشنهاد برای یکسان بودن فایل‌های ارسالی
جایگاه Variant را روی Transcript پیدا کنید
بعد از انتخاب Transcript صحیح، باید HGVS را تفسیر کنید، مشخص کنید Variant در کدام Exon قرار گرفته و سپس همان موقعیت را در توالی مورد استفاده خود پیدا و در فایل Word مشخص کنید.
شماره‌گذاری cDNA را با مختصات Genomic اشتباه نکنید
اگر Variant به‌صورت c.218A>G نوشته شده باشد، عدد 218 در سیستم شماره‌گذاری coding DNA برای همان Transcript مرجع تعریف شده است. این عدد به این معنی نیست که Variant در باز شماره 218 کروموزوم یا حتی باز شماره 218 از کل توالی ژنومی ژن قرار دارد.
Transcript را دوباره کنترل کنید
قبل از تفسیر موقعیت Variant مطمئن شوید دقیقاً از همان Transcript accession و Version تعیین‌شده در مأموریت استفاده می‌کنید.
عبارت HGVS را تجزیه کنید
در c.218A>G ابتدا نوع شماره‌گذاری، سپس موقعیت و در نهایت تغییر نوکلئوتیدی را مشخص کنید.
Exon مربوط به Variant را پیدا کنید
ساختار Transcript را بررسی کنید و مشخص نمایید موقعیت موردنظر در کدام Exon قرار گرفته است. شماره Exon باید توسط خود شما استخراج شود.
موقعیت را روی توالی خودتان پیدا کنید
حالا همان محل را در توالی‌ای که برای فایل Word آماده کرده‌اید پیدا کنید و مطمئن شوید Reference nucleotide با HGVS داده‌شده مطابقت دارد.
نوکلئوتید Variant را Highlight کنید
نوکلئوتید مربوط به Variant را در فایل Word با Highlight مشخص کنید تا محل آن نسبت به Exon، Intron و ناحیه هدف کاملاً قابل مشاهده باشد.
از HGVS تا محل واقعی Variant
نمودار زیر فقط برای آموزش مفهوم است و شماره Exon مأموریت واقعی را نشان نمی‌دهد.
این دو نوع موقعیت را با یکدیگر یکی نگیرید
موقعیت نسبت به Transcript مرجع و سیستم شماره‌گذاری coding DNA تعریف می‌شود؛ مانند c.218.
مختصات واقعی Variant روی کروموزوم و Assembly ژنومی است و معمولاً عدد کاملاً متفاوتی دارد.
خروجی این مرحله برای هر مأموریت
- Transcript صحیح را تأیید کنید.
- Exon حاوی Variant را مشخص کنید.
- محل Variant را روی توالی خودتان پیدا کنید.
- Reference nucleotide را با HGVS تطبیق دهید.
- نوکلئوتید Variant را در فایل Word Highlight کنید.
Target Region مناسب را در اطراف Variant انتخاب کنید
حالا که محل Variant را پیدا کرده‌اید، باید ناحیه‌ای از توالی اطراف آن را برای طراحی Primer انتخاب کنید. هدف این است که Variant داخل Amplicon نهایی قرار بگیرد و در دو سمت آن نیز توالی کافی برای انتخاب Primerهای مناسب وجود داشته باشد.
Target Region فقط خود Variant نیست
برای طراحی Primer نمی‌توان تنها نوکلئوتید تغییرکرده را به نرم‌افزار داد. باید بخشی از توالی در دو طرف Variant را نیز در اختیار داشته باشیم تا بتوان Forward و Reverse Primer مناسب را در اطراف ناحیه موردنظر انتخاب کرد.
از محل Variant شروع کنید
ابتدا همان نوکلئوتیدی را که در مرحله قبل پیدا و Highlight کرده‌اید به‌عنوان نقطه مرجع در نظر بگیرید.
توالی دو طرف Variant را بررسی کنید
ناحیه‌های قبل و بعد از Variant همان Flanking Sequence هستند و برای پیدا کردن محل‌های مناسب اتصال Primer اهمیت دارند.
یک محدوده مناسب انتخاب کنید
محدوده‌ای از توالی را انتخاب کنید که Variant درون آن قرار داشته باشد و در دو سمت آن فضای مناسبی برای طراحی Primer وجود داشته باشد.
ساختار Exon و Intron را فراموش نکنید
هنگام کار روی DNA ژنومی، Target Region ممکن است شامل بخش‌هایی از Exon و Flanking Intronic Sequence باشد. بنابراین ساختار ژن را همزمان با توالی بررسی کنید.
Target Region را در Word مشخص کنید
محدوده انتخاب‌شده را با Highlight یا رنگ مشخص از سایر بخش‌های توالی جدا کنید تا در ادامه محل Primerها روی همان توالی ثبت شود.
Variant باید داخل محدوده‌ای قابل تکثیر قرار بگیرد
شکل زیر صرفاً شماتیک است و اندازه واقعی Target Region یا Amplicon مأموریت‌های BTD و TMEM38B را نشان نمی‌دهد.
هنگام انتخاب Target Region این چهار سؤال را از خودتان بپرسید
این سه لایه را در فایل Word از هم متمایز کنید
دانشجو باید بتواند با نگاه به توالی نشان دهد خود Variant کجاست، چه محدوده‌ای را برای طراحی Primer انتخاب کرده و توالی‌های اطراف آن در کجا قرار دارند.
طراحی Primer در PerlPrimer
Target Region آماده‌شده را وارد PerlPrimer کنید و Primer Pairهای پیشنهادی را براساس معیارهایی که در دوره آموزش داده شده‌اند بررسی نمایید. در این مرحله باید فقط Primer تولید نکنید؛ بلکه مشخصات هر Primer Pair را مقایسه و انتخاب خود را مستند کنید.
تنظیمات عددی این تمرین باید مطابق آموزش مدرس باشد
مقادیر دقیق Primer Length، Tm، GC% و Amplicon Size در این صفحه عمداً تعیین نشده‌اند. این مقادیر باید دقیقاً مطابق معیارهایی باشند که مدرس در دوره آموزش داده است و نباید یک عدد عمومی یا فرضی را به‌عنوان معیار رسمی تمرین جایگزین کرد.
توالی Target Region را وارد کنید
همان توالی‌ای را که در مرحله قبل برای طراحی انتخاب و در فایل Word مشخص کرده‌اید، وارد PerlPrimer کنید. قبل از ادامه مطمئن شوید توالی مربوط به ژن و Transcript صحیح است.
محدوده Primer Length را تنظیم کنید
طول Primerها را براساس محدوده‌ای که مدرس در دوره مشخص کرده است تنظیم کنید. این معیار باید برای Forward و Reverse Primer هنگام مقایسه گزینه‌ها در نظر گرفته شود.
Melting Temperature را بررسی کنید
Tm هر دو Primer را بررسی کنید و تنها Pairهایی را نگه دارید که با معیار تعیین‌شده مدرس سازگار باشند. علاوه بر مقدار هر Primer، ارتباط Tm دو Primer یک Pair نیز باید بررسی شود.
GC% را کنترل کنید
درصد GC هر Primer را در خروجی بررسی کنید و آن را با محدوده موردنظر مدرس تطبیق دهید. نتیجه این بررسی را نیز برای Primer Pair منتخب در فایل Word ثبت کنید.
Amplicon Size را تنظیم کنید
محدوده اندازه محصول PCR را براساس معیار آموزشی دوره مشخص کنید و مطمئن شوید Variant داخل Amplicon حاصل از Primer Pair قرار می‌گیرد.
Primer Pairهای پیشنهادی را مقایسه کنید
تنها اولین Pair پیشنهادشده را انتخاب نکنید. چند گزینه مناسب را از نظر Sequence، Length، Tm، GC% و Product Size با یکدیگر مقایسه کنید.
چه اطلاعاتی را باید هنگام طراحی کنترل کنید؟
برای هر Primer Pair پیشنهادی، این پارامترها را بررسی کنید. کادرهای زرد عمداً فاقد عدد هستند تا معیار رسمی مدرس بعداً در آن‌ها قرار گیرد.
طول Forward و Reverse Primer را بررسی کنید.
Tm هر Primer و تناسب آن در Primer Pair را بررسی کنید.
درصد GC هر Primer را از خروجی ثبت کنید.
اندازه محصول مورد انتظار PCR را بررسی کنید.
نمونه ساختار اطلاعات یک Primer Pair
آیا اولین Primer Pair را انتخاب می‌کنیم؟
↓
نگه داشتن به‌عنوان Candidate
↓
بررسی Primer Pair دیگر
از Primer Pair منتخب چه اطلاعاتی را در Word ثبت کنیم؟
بررسی Primer-Dimer در PerlPrimer
Primer Pair پیشنهادی هنوز Primer نهایی نیست. قبل از رفتن به مرحله بررسی اختصاصیت باید احتمال تشکیل Dimer را بین Primerها بررسی کنید و فقط Pair مناسب را برای مراحل بعد نگه دارید.
هر Primer Pair باید از سه جهت بررسی شود
فقط بررسی Forward و Reverse در کنار هم کافی نیست. برای هر Candidate Pair باید Forward–Forward، Reverse–Reverse و Forward–Reverse را بررسی کنید و نتیجه هر سه حالت را در تصمیم نهایی در نظر بگیرید.
Forward – Forward
Forward Self-Dimerبررسی کنید آیا دو مولکول Forward Primer می‌توانند با یکدیگر Complementarity قابل توجه ایجاد کنند یا خیر.
Reverse – Reverse
Reverse Self-Dimerهمین بررسی را برای Reverse Primer انجام دهید و احتمال اتصال دو Reverse Primer به یکدیگر را ارزیابی کنید.
Forward – Reverse
Hetero-Dimerدر مرحله سوم بررسی کنید Forward و Reverse Primer تا چه اندازه می‌توانند با یکدیگر Complementarity ایجاد کنند.
مسیر بررسی هر Primer Pair
هنگام مشاهده نتیجه Dimer به چه چیزهایی توجه کنیم؟
بعد از بررسی Dimer چه تصمیمی می‌گیریم؟
↓
Primer Pair را برای مرحله بعد نگه دارید
↓
Pair را کنار بگذارید و گزینه دیگری بررسی کنید
بررسی اختصاصیت Primer با NCBI BLAST
Primer Pairی که مرحله Dimer Check را پشت سر گذاشته است، هنوز باید از نظر اختصاصیت اتصال بررسی شود. در این مرحله توالی Primerها را ارزیابی می‌کنید تا مشخص شود آیا عمدتاً ناحیه موردنظر را هدف می‌گیرند یا احتمال اتصال‌های غیراختصاصی مهم نیز وجود دارد.
آیا Primerها ناحیه موردنظر را به‌صورت مناسب هدف می‌گیرند؟
هدف این است که قبل از رفتن به مراحل بعد، اتصال‌های احتمالی Primerها به نواحی دیگر را بررسی کنید و در صورت مشاهده مشکل مهم، همان Primer Pair را کنار بگذارید.
Primer Pair عبورکرده از Dimer Check را بردارید
فقط Primer Pairهایی را وارد این مرحله کنید که بررسی Forward–Forward، Reverse–Reverse و Forward–Reverse را پشت سر گذاشته‌اند.
توالی Primerها را آماده کنید
توالی دقیق Forward و Reverse Primer منتخب را از PerlPrimer بردارید و از درست بودن جهت و Sequence ثبت‌شده اطمینان حاصل کنید.
Primerها را در NCBI بررسی کنید
توالی Primer را براساس روش آموزش‌داده‌شده توسط مدرس در محیط NCBI بررسی کنید و Hitها و محل‌های احتمالی اتصال را ارزیابی نمایید.
نتایج غیراختصاصی را بررسی کنید
وجود Match با نواحی دیگر را بررسی کنید و مشخص نمایید آیا نتیجه می‌تواند از نظر اختصاصیت Primer مشکل‌ساز باشد یا خیر.
برای Primer Pair تصمیم بگیرید
اگر نتیجه مناسب بود، Pair را برای مرحله بعد نگه دارید. اگر اختصاصیت مناسب نبود، به PerlPrimer برگردید و Pair دیگری انتخاب کنید.
Primer منتخب را در برابر توالی‌های دیگر ارزیابی کنید
نمایش زیر فقط برای توضیح مفهوم Hit و اتصال احتمالی است و خروجی واقعی BLAST هیچ‌یک از مأموریت‌های تمرین نیست.
هنگام بررسی نتیجه، این سؤال‌ها را از خودتان بپرسید
طراحی Primer یک مسیر خطی نیست؛ یک چرخه انتخاب و ارزیابی است
از SNPCheck تا In-Silico PCR
Primer Pairی که از بررسی Dimer و اختصاصیت عبور کرده است، حالا باید از نظر Variantهای محل اتصال Primer بررسی شود و سپس محصول PCR آن به‌صورت In-Silico ارزیابی گردد.
محل اتصال Primer را از نظر SNP بررسی کنید
Forward و Reverse Primer منتخب را از نظر وجود SNP یا Polymorphism در محل اتصال بررسی کنید. مطابق دستور مدرس، توجه ویژه‌ای به پنج نوکلئوتید انتهای 3′ Primer داشته باشید.
Primer Pair تأییدشده را بردارید
فقط Primerهایی را وارد این مرحله کنید که قبلاً از Dimer Check و بررسی اختصاصیت عبور کرده‌اند.
Forward Primer را بررسی کنید
محل اتصال Forward Primer را از نظر وجود SNPها و Variantهای شناخته‌شده بررسی و نتیجه را ثبت کنید.
Reverse Primer را بررسی کنید
همین بررسی باید به‌صورت مستقل برای محل اتصال Reverse Primer نیز انجام شود.
پنج نوکلئوتید انتهای 3′ را جداگانه ببینید
در این تمرین باید پنج باز انتهایی سمت 3′ Primer با حساسیت بیشتری بررسی شوند.
درباره Primer تصمیم بگیرید
نتیجه را براساس معیار آموزش‌داده‌شده توسط مدرس ارزیابی کنید و مشخص کنید Primer قابل ادامه است یا باید گزینه دیگری انتخاب شود.
چرا انتهای 3′ را جداگانه بررسی می‌کنیم؟
محل Variant نسبت به کل Primer اهمیت دارد. طبق روش این تمرین، وجود SNP در پنج باز انتهایی سمت 3′ باید با دقت بیشتری بررسی شود؛ زیرا این ناحیه در عملکرد Primer اهمیت زیادی دارد.
محصول PCR نهایی را به‌صورت In-Silico بررسی کنید
Forward و Reverse Primer تأییدشده را در ابزار In-Silico PCR وارد کنید و بررسی نمایید آیا محصول مورد انتظار با طراحی شما سازگار است یا خیر.
نمایش شماتیک نتیجه مورد انتظار
EXAMPLE ONLYقبل از تأیید Primer Pair این چهار مورد را کنترل کنید
حالا چرخه ارزیابی Primer شما کامل شده است
جدول نهایی Primerهای منتخب
بعد از اینکه Primer Pairهای شما مراحل طراحی، Dimer Check، BLAST، SNPCheck و In-Silico PCR را پشت سر گذاشتند، اطلاعات نهایی هر Primer را به‌صورت منظم در جدول پایانی فایل Word ثبت کنید.
این جدول باید در انتهای فایل Word قرار گیرد
برای هر ژن، Forward و Reverse Primer را در دو ردیف جداگانه ثبت کنید. Sequenceها باید در جهت 5′ → 3′ نوشته شوند و مشخصات عددی نیز دقیقاً از Primer Pair نهایی استخراج شوند.
جدول استاندارد گزارش Primerها
خانه‌های «...» باید توسط دانشجو با اطلاعات Primer Pair نهایی تکمیل شوند.
| Gene | Primer | Sequence 5′→3′ | Length | Tm | GC% | Product Size |
|---|---|---|---|---|---|---|
| BTD | Forward | ... | ... | ... | ... | ... |
| BTD | Reverse | ... | ... | ... | ... | ... |
| TMEM38B | Forward | ... | ... | ... | ... | ... |
| TMEM38B | Reverse | ... | ... | ... | ... | ... |
نتیجه اعتبارسنجی Primer Pair نهایی
در کنار جدول Primerها، نتیجه چهار مرحله اصلی ارزیابی را نیز ثبت کنید تا مشخص باشد Primer Pair نهایی از چه بررسی‌هایی عبور کرده است.
نتیجه بررسی F–F، R–R و F–R برای Primer Pair نهایی.
نتیجه بررسی اختصاصیت Primer و Hitهای احتمالی.
نتیجه بررسی SNPها، مخصوصاً پنج نوکلئوتید انتهای 3′.
نتیجه بررسی محصول PCR و موقعیت Primerها در UCSC.
بخش توالی و Annotate فایل Word
- توالی ژن و ناحیه مورد استفاده
- Exon و Intron
- محل Variant
- Target Region
- محل Forward و Reverse Primer
- محدوده Amplicon
بخش نتیجه نهایی فایل Word
- جدول Forward و Reverse Primer
- Sequence در جهت 5′→3′
- Length، Tm و GC%
- Product Size
- نتیجه Dimer و BLAST
- نتیجه SNPCheck و In-Silico PCR
سؤالات تحلیلی تمرین
طراحی Primer فقط وارد کردن توالی در چند نرم‌افزار نیست. در این بخش باید نشان دهید چرا یک Primer را انتخاب یا رد کرده‌اید و منطق علمی مراحل طراحی و ارزیابی را درک کرده‌اید.
پاسخ‌ها را با استدلال خودتان بنویسید
هدف این سؤالات پیدا کردن یک جمله آماده نیست. هنگام پاسخ دادن از اتفاقاتی که در طراحی Primerهای BTD و TMEM38B دیده‌اید استفاده کنید و توضیح دهید هر معیار چگونه می‌تواند بر انتخاب Primer Pair اثر بگذارد.
چرا در این طراحی بهتر است Variant در موقعیت مناسبی داخل Amplicon قرار بگیرد و بیش از حد به انتهای محصول موردنظر نزدیک نباشد؟
چرا دو Primer با Tm بسیار متفاوت معمولاً انتخاب مناسبی برای یک Primer Pair نیستند؟
چرا GC% یکی از پارامترهایی است که هنگام انتخاب Primer بررسی می‌شود؟
چرا بررسی Dimer فقط برای Forward و Reverse Primer به‌صورت جداگانه کافی نیست؟
چرا بعد از طراحی Primer در PerlPrimer هنوز لازم است Primerهای منتخب را از نظر اختصاصیت بررسی کنیم؟
چرا هنگام بررسی SNPها، وجود Variant در انتهای 3′ Primer اهمیت بیشتری پیدا می‌کند؟
اگر یک Primer Pair از نظر Dimer مناسب باشد اما در بررسی اختصاصیت نتیجه قابل قبول نداشته باشد، چه تصمیمی می‌گیرید و مرحله بعد چیست؟
چرا Reverse Primer را هنگام مقایسه با توالی مرجع به شکل متفاوتی مشاهده می‌کنیم؟
در پاسخ‌ها فقط «درست یا غلط» ننویسید
تمرین را تکمیل و ارسال کنید
بعد از تکمیل طراحی Primer برای BTD و TMEM38B، فایل Word نهایی را آماده کنید، آن را از طریق فرم ارسال تمرین بارگذاری کنید و سپس ارسال پاسخ را در بخش دیدگاه‌ها اعلام نمایید.
۱. قالب Word تمرین را دریافت کنید
Exercise 03 Answer Templateتمام مراحل انجام تمرین باید در یک فایل Word نهایی مستند شوند.
۲. فایل تکمیل‌شده را ارسال کنید
DOCX Submissionبعد از تکمیل فایل، آن را ذخیره کنید و از طریق فرم واقعی ارسال تمرین که دقیقاً در پایین همین بخش قرار دارد بارگذاری نمایید.
ارسال پاسخ تمرین
پاسخ خود را در فایل Word با فرمت DOCX آماده کنید و از فرم زیر ارسال نمایید. حداکثر حجم فایل ۵ مگابایت است.
دوره: بیوانفورماتیک مقدماتی
پاسخ تمرین ارسال شد.
نام و نام خانوادگی: [نام کامل شما]
بعد از ارسال فایل، یک دیدگاه ثبت کنید
فقط بعد از اینکه فایل DOCX با موفقیت در فرم بالا ارسال شد، به بخش دیدگاه‌های همین صفحه بروید و ارسال پاسخ خود را اعلام کنید.